DETERMINACIÓN DE LA HEMOGLOBINA
Objetivo:
Determinar
cuántos gr de hemoglobina (Hb) hay en toda la sangre circulante, para tener un diagnóstico
clínico ya que se pueden variar diversas enfermedades debido a un valor anormal
de Hemoglobina.
Fundamento:
La
hemoglobina es una proteína conjugada que sirve para el transporte de oxígeno y
dióxido de carbono. La masa total de eritrocitos de un adulto contiene unos
600gr. De hemoglobina capaces de transportar 800ml de oxígeno.
Una
molécula de hemoglobina consta de 2 pares de cadenas polipepticas (unión de
aminoácidos) (globina) y 4 grupos proteicos HEM que contienen cada uno un átomo
de fe en estado ferroso. Cada punto HEM se localiza en una zona determinada de
una de las cadenas de polipepticos. Localizando cerca la superficie de la
molécula, el HEM se combina de forma reversible con una molécula de oxígeno y
dióxido de carbono. Este grupo HEM es el responsable del del color rojo de la
hemoglobina (hb).
La
parte proteica o globina tiene 4 cadenas poli peptídicas que se denominan con
las letras α, β, γ, δ. Existe una cadena más la ε que está presente durante los 3 primeros meses de
vida se diferencian unas de las otras en el numero o posición (de los aminoácidos de los que están compuestas). Por lo tanto existen
varios tipos de hb. en el ser humano se pueden encontrar las siguientes
hemoglobinas normales:
Hemoglobina
A: consta de 2 cadenas α y 2 cadenas β en un adulto normal corresponde a más del 95% del
total.
Hemoglobina
A´: consta de 2 cadenas α y 2 cadenas δ en un adulto sano esta en porción menor de 3%.
Hemoglobina
F (fetal): consta de 2 cadenas α y 2 cadenas γ. Es la hemoglobina principal en el feto desde el 4° mes del embarazo hasta
aproximadamente los 6 meses de edad. La Hb F tiene mayor afinidad por el oxígeno.
Hemoglobina
Gower: consta de 2 cadenas α y 2 cadenas ε. Desaparece casi por completo en el tercer mes de
embarazo y empieza a aparecer la Hb fetal.
Algunos
datos se obtiene examinando a simple vista una muestra de sangre. Un aspecto
normal del suero o del plasma revela que el pigmento esta en los glóbulos
rojos. Si se agita en una sangre total normal en el aire durante 15 min. Adquiere
un color rojo claro por convertir la Hb en oxihemoglobina.
La
sangre tiene un color rojo cereza brillante cuando el pigmento es
carboxi-hemoglobina en la intoxicación por CO. El color es chocolate en la
metahemoglobulemia y la banda malvada en alsulfohemoglobulemia.
Las
distintas Hb tienen espectros de absorción características a las que determina
en un espectofotometro. La identificación de diferentes formas de la Hbcon la
determinación de sus espectros de absorción puede hacerse de una manera
sencilla
Material y
Equipo:
v Un colorímetro fotoeléctrico o un espectrofotómetro.
v Una pipeta de vidrio graduada de 5 mL
v Pipeta semiautomática
v Tubos de ensayo.
v Cubetas cuadradas.
v Gradilla
v gasa
Reactivos:
EDTA
Reactivo Drabkin
Ferrocianuro de potasio
Cianuro de potasio
Bicarbonato de potasio
Solución estándar de cianometahemoglobina
Reactivos
biológicos:
Ø Sangre venosa con EDTA.
Técnica:
1.-En un tubo de 13 x 100 colocar exactamente 5 mL de reactivo de
Drabkin, marcarlo como problema (P).
2.-Obtener 5 ml de sangre venosa con anticoagulante (EDTA).
3.- Mezclar perfectamente la sangre problema, por inversión por lo menos
20 veces antes de tomar la muestra.
4.-Con una pipeta automática o pipeta de Shali se toma exactamente 0,02
mL (20 µL) de sangre total, limpiar luego la punta de la pipeta.
5.-La sangre tomada del tubo con EDTA se vierte en el tubo que contenga
reactivo de Drabkin. Se enjuaga 3 veces y se mezcla.
6.- Mezcle la solución de Drabkin con la sangre por inversión y con
mucha precaución (utiliza parafilm para tapar los tubos, recuerda que el
reactivo tiene cianuro, el cual es un VENENO).
7.-Dejar en reposo por espacio de 3 a 5 minutos. Para que se efectúe la reacción.
8.-Después de ese tiempo se observara una coloración roja transparente,
se llena las cubetas hasta la marca que se encuentra y se procede la lectura.
9.-Leer en absorbancia con filtro verde a 540 nm llevando a cero el
fotómetro con agua destilada / Drabkin.
Antes de hacer la
medición con el espectrofotómetro hacer el siguiente procedimiento
PARA HACER LA MEDICION DE TRANSMITANCIA HACER EL
SIGUIENTE PROCEDIMIENTO:
Medición de Transmitancia:
1.- Encender el
Espectrofotómetro 30 minutos antes, después
seleccione la longitud de onda deseada (540 nm para Hb) con las teclas
numéricas y oprima <GO TO>.
Aparecerá en la pantalla el valor numérico.
2.-Presine < %T> para
Transmitancia.
Aparecerá en la pantalla “T”.
3.-Insertemla cubeta con el
blanco en el portacubeta, cierre la puerta y oprima <SECOND FUNCTION> Y
<100 %>. Aparecerá En la pantalla 100.0 T.
4.-Remueva el blanco e inserte
la muestra problema contenida en la celda y cierre la puerta.
Aparecerá en la pantalla el valor en
Transmitancia.
5.-Si desea imprimir, oprima
<PRINT> para avance de papel y/o una segunda vez para la impresión en el
papel del espectrofotómetro o <SECND REMOTE> para mandar a un dispositivo externo (a la
computadora).
6.-Retire la cubeta del
compartimiento y cierre la puerta (lave la cubeta y guárdela).
7.- para entender lo hablado
ver la imagen siguiente:
8.-Si no va usar más el
aparato, apáguelo y cúbralo, si desea continuar trabajando, elija el modo de
trabajo siguiente y continúe.
Resultado:
(A) Muestrax15= gr/dL
(A) PATRON
.392X15=177.29gr/Dl (hombre )
.340
.304x15=13.441gr/Dl
(mujer)
.340
RANGO :
|
MUJER
|
HOMBRE
|
|
12-16
|
14-17
|
TODO PARECE INDICAR QUE LOS PACENTES TIENEN L
NIVEL DE HB DENTRO DE LOS RANGOS NORMALES .
